一朝被蛇咬，十年怕井绳！
恐惧过度泛化，即对原本无害的刺激或情境产生不适当的恐惧反应，常见于创伤后应激障碍（Post traumatic stress disorder，PTSD）和其他焦虑障碍中。背侧齿状回（dosal Dentate gyrus，dDG）存在一些特殊的神经细胞群体，即印迹细胞（engram），它们负责编码恐惧记忆，并在精确回忆这些记忆时发挥关键作用。然而，目前恐惧泛化过程中dDG神经网络的协调机制尚不明晰。
2024年7月12日，北京大学基础医学院伊鸣课题组在PLOS biology杂志上发表的文章揭示了过度恐惧泛化的神经机制。该研究采用活性神经元标记系统和双光子钙成像技术，通过探究DG神经元网络在恐惧泛化中的活动发现：在相似环境下，恐惧泛化现象是由于大脑中与恐惧相关的存储记忆（engram）集群在齿状回（dDG）中相对于其他非恐惧记忆集群具有更强的竞争优势。通过激活腹侧苔藓细胞（ventral Mossy cell，vMC）到齿状回（dDG）的神经通路，可以降低恐惧记忆集群的竞争优势，进而减轻恐惧泛化。
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恐惧会在相似情境中发生不同程度的泛化
首先，作者采用经典的情境恐惧条件反射（Context Fear Conditioning，CFC）实验，训练小鼠将环境（Context A）与两组不同强度的厌恶刺激（足部电击）之间的联合学习。在恐惧记忆提取测试中，小鼠展现出了对特定环境（Context A）的恐惧反应，表现为身体僵硬（freezing），则表明小鼠学会了恐惧与情境的关联。为了探究在相似情境中是否存在恐惧的泛化，研究人员利用tet-off系统标记了小鼠在特定环境（context A）中与恐惧相关的dDG engram集群，在CFC训练后，他们在一个相似情境context B中测试小鼠的反应。结果发现：小鼠在context B中也表现出了恐惧反应freezing；此外，还发现，接受微弱电击（weak shock，WS）的小鼠相比接受强烈电击（strong shock，SS）的小鼠，其恐惧泛化的程度要低。这表明受实验条件的影响，恐惧会在相似情境中发生不同程度的泛化。
图1 相似情境下恐惧泛化过程存在dDG中恐惧engram的高度再激活
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dDG的engram在恐惧泛化过程中活跃且部分神经元被小鼠僵直行为激活
为了探究在相似情境中发生恐惧泛化的神经机制，研究人员在活性标记系统的基础上结合了双光子钙成像技术，在体追踪了小鼠恐惧相关的dDG engram在恐惧泛化过程的动态活动。结果发现：在恐惧泛化过程中，这群dDG engram集群显示更高水平的钙活动，并且SS组中恐惧相关的engram集群的数量比例高于WS组。进一步分析这群dDG engram的活动与小鼠的僵直行为（freezing）之间的关系，发现：这群dDG engram中有更多的神经元在小鼠表现出僵直时被激活，且在SS组中，这些被僵直行为激活的神经元比例高于WS组。
图2 在相似环境中，dDG恐惧engram的活动是恐惧泛化的充分和必要条件
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光遗传功能验证表明dDG engram在恐惧泛化过程中的充分必要性
鉴于双光子监测到dDG engram在恐惧泛化过程中活动增加，研究人员进一步结合光遗传技术对这群dDG engram进行功能验证。结果发现：光遗传激活这些与恐惧相关的印迹细胞集群会加剧小鼠的恐惧泛化反应，而抑制这些集群的活动则能够减轻恐惧泛化的程度。同时光遗传激活在相似情境context B中标记到的恐惧泛化相关engram集群，小鼠在另一安全环境context C中也表现出恐惧泛化。
图3 dDG恐惧engram的激活对恐惧泛化是充分和必要的
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dDG engram与non-engram的竞争作用介导恐惧泛化过程
dDG 中除了编码恐惧的engram以外还有许多非记忆印记细胞（non-engram），研究人员进一步探究了dDG engram相较于non-engram在恐惧泛化过程中的竞争优势是否是导致恐惧泛化的神经基础。他们分别标记并光激活了小鼠在安全环境（Context C）和恐惧环境（Context A）中活跃的细胞集群，发现：当抑制dDG中与恐惧记忆相关的印记细胞集群的竞争优势时，小鼠在相似环境中的恐惧泛化程度显著降低。
图4 抑制dDG神经网络中engram的竞争优势可减弱恐惧泛化
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抑制vMC与dDG的投射网络能减弱恐惧泛化程度
为了揭示dDG神经元网络在恐惧泛化中的作用机制，研究人员采用病毒逆向示踪技术，确定了dDG的上游输入脑区。他们特别发现在腹侧DG（vDG）的hilus区，腹侧苔藓细胞（ventral Mossy cell，vMC）与dDG的颗粒细胞存在密集的连接，并且在恐惧泛化过程中vMCs的活动被抑制。进一步通过化学遗传学手段调控vMCs，研究人员发现，激活vMCs到dDG的投射通路能够降低dDG中恐惧记忆相关印迹细胞的竞争优势，进而减少恐惧泛化的程度。
图5 恐惧泛化过程中vMC活动被抑制
图6 vMC-dDG通路的激活降低了dDG神经元网络中恐惧engram的竞争优势，减弱了恐惧泛化
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治疗恐惧泛化的新思路：增加环境丰容度
如何减弱恐惧泛化呢？最后，研究人员采取了提高环境丰富度的策略，并通过化学遗传手段激活了恐惧相关engram。他们发现这种方法能降低小鼠的恐惧泛化程度。通过改变环境和神经网络的活动，这一发现为减轻过度恐惧泛化，例如在PTSD和其他焦虑障碍中观察到的现象，提供了新的治疗途径。
图7 在dDG中调控恐惧engram有效地挽救了恐惧泛化
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总结
综上所述,这项研究为深入理解恐惧泛化的神经基础提供了新的视角。研究发现，dDG网络中恐惧记忆engram细胞的竞争优势是恐惧泛化的基础。抑制dDG神经网络中engram的竞争优势可减弱恐惧泛化，同时激活从vMC到dDG的通路可抑制过度泛化恐惧。这些发现为理解dDG网络活动如何导致焦虑障碍中观察到的不适应性恐惧广泛化提供了见解，为治疗创伤后应激障碍(PTSD)等焦虑障碍提供新的神经机制依据。
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